一文看懂显微注射法的原理及应用

将外源基因导入靶细胞的方法有很多，其中一种比较普适、成功率又比较高的方法为显微注射法。

首先，我们说说这种方法的原理：显微注射法即是利用管尖极细（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射针，将外源基因片段直接注射到原核期胚或培养的细胞中，然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组、缺失、复制或易位等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内，实现宿主细胞的基因改造。

一般的动物细胞，直径大约10微米左右；人类真核细胞直径范围在：3～30微米，其中人卵细胞直径约为100微米。故直径为0.2微米的显微注射器针头可以为各种类型和任意大小的动物细胞提供精准的、重复性良好的细胞内和细胞旁注射。在注射的过程中，动物细胞膜也会被刺破。但因为动物细胞膜良好的弹性和流动性，在细胞膜被刺破以及细胞内注入或者抽取点物质之后，细胞膜还是可以恢复完整的，恢复好的细胞可以继续存活，正常生长。当然操作手法也会影响实验的成功率，针对不同细胞的操作手法方面的研究，现在也有很多文章发表出来。

显微注射技术的长处为：任何DNA在原则上均可传入任何种类的动物细胞内，对于所转的外源基因没有长度上的限制，目前已证明数百kb的DNA片段均可以成功转入靶细胞并整合进其染色体组。操作过程如图所示：

接下来，我们再说说显微注射器针头的制作：显微注射过程中使用的微量移液管是用微电极拉制仪来制作的，先将玻璃毛细管加热到其熔化的温度，再将其拉制成所需的合适大小的直径和锥形，微量移液管小头的直径（小至0.2微米）与纤维操纵器的高精度相关，它可以用于精准的移液。

    SUTTER微电极拉制仪P-000                                                日本NARISHIGE拉制仪PC-100

显微注射器的结构如下图所示：

注射器中加好需要注射的样品之后，通过运用显微注射仪（压力注射）可以获得将微量移液管中的物质挤喷入靶细胞中。

               日本NARISHIGE显微注射仪IM-400    

                                       美国warner显微注射仪PLI-100A

现在，我们来归纳一下显微注射法的应用：

（一）显微注射法可用来做转基因动物：显微注射技术是利用显微操作系统和显微注射技术将外源目的基因直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到受体细胞的基因组内，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体动物的孑宫内发育，从而获得转基因动物。显微注射法是目前转移效率基较好的一种基因转移方法，可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移；外源基因的长度不受限制, 可达100kb ；实验周期相对比较短。它的不足之处是 ：导入外源基因整合位点和拷贝数无法控制；常导致插入位点附近宿主DNA 片段缺失、重组等突变，可造成动物严重的生理缺陷。尽管如此，由于显微注射技术直接对基因进行操作，整合率较高，因而仍是目前建立转基因动物极为重要的方法。

（二）显微注射法在植物、动物的细胞发育研究的应用：将特定的分子探针及衍生的细胞间质成分导入活体细胞，为研究控制细胞功能的调控机制提供了新的视野。

（三）显微注射法用于做克隆动物：供体细胞的细胞核用显微注射器移入卵母细胞后，在卵母细胞相关因子的作用下，发生了重编程回复到发育的起点状态。核重编程的过程就是使在体细胞中被关闭，而在正常胚胎发育中表达的基因重新被激活的过程。

重编程有三种可能的结果：

1，供核基因组没有进行重编程，重构胚很快死亡；

2，部分重编程，重构胚在不同的发育阶段死亡 ；

3，重编程，产生正常的克隆动物。

（四）显微注射器可以实现单细胞提取：在不改变细胞生存环境的情况下，用显微注射器对单个细胞进行活细胞提取。可单独提取细胞质或细胞核，或者同时提取提取细胞质和细胞核。提取后细胞仍可存活。相比于传统的裂解方式，用显微注射器提取的样本更为干净，可以得到很好地电镜图像。

（五）显微注射法可以实现更优的CRISPR-Cas转染方式：显微注射器能够进行高速、高效地将CRISPR-Cas复合物注入细胞，帮助您克服对于传统方式极难转染的细胞基因编辑问题。

我们再介绍一下显微注射法的具体操作过程，显微注射实验的操作需要在显微镜下进行，如图所示：

（一）在注射针内装液：使用无菌的微量加样器从微注射针的后部加入待注射样品。

（二）注射针安装和定位：

1， 将装液后的针头的游离端安在连接器上，然后旋紧连接器以固定针头，再将其固定到微操作仪的托针管上。

2， 把载有待注射样本的培养皿放在显微镜载物台上，用低倍物镜对准细胞调焦；

3， 移动针头并在显微镜下调整微操作仪，直到针头的阴影在视野的中心上方；

4， 使用工作用放大倍数，调准细胞焦距，找到针尖。

（三）显微注射：

1，使针尖对准细胞的待注射部位（细胞与针尖在同一焦面上），旋转推进旋钮，针刺入细胞内（卵膜、细胞膜、核膜）。

2， 旋转加样旋钮，将样本加入，并离开细胞。

余下，就是将操作好的细胞放回好好培养，实验结束。

显微注射法的缺点是：实验所需的设备精密而昂贵、操作技术需要长时间的练习，以及每次只能注射有限的细胞。